Méthodes de diagnostic en virologie

- avec une coloration négative : il faut beaucoup de virus dans les lésions
on reconnaît les capsides

Vision claire des structures des virus

- sur des coupes de tissu

Les types de cultures :

- lignées primaires (primo exploitation )
On vient d’explanter les cellules
Les cellules sont fraîches donc elles possèdent leurs caractéristiques de différenciation cellulaire et les récepteurs sur la membrane.
Certains virus ne poussent que dessus

- lignées secondaires
Elles ont perdu quelques caractéristiques
l’absence de certaines glycoprotéines à leur surface ne permet pas l’encrage de certains virus

- lignées continues ( cellules immortelles )
les plus faciles à utiliser

Selon les lignées on a le diagnostic car on connaît quel virus refuse de pousser sur tel type de culure.
On parle de caractère différentiel selon les lignées .

Définition : modifications morphologiques et/ou biochimiques des cellules infectées
Modifications parfois caractéristiques d’un virus ou groupe de virus

Certains virus n’ont pas d’ECP caractéristiques. Certaines modifications sont visibles après fixation et coloration des cellules infectées .

ECP de l’adénovirus : en dentelle
ECP du virus respiratoire syncitial : donne des syncitiums , beaucoup de noyaux agglomérés et pas de limite cellulaire
ECP de la rougeole : syncitiums et inclusion dans les noyaux
ECP de l’herpès : foyer de lyse , noyaux très condensés , de moins en moins de cytoplasme … elles meurent

rapide : visible quelques heures après infection
Herpès virus : ECP visible 24 heures après infection alors que 2 heures suffisent pour cette méthode

• par agglutination

très rapide ( 15 mn)

• par immunofluorescence directe

Il existe un fort bruit de fond donc méthode indirecte .

• par immunofluorescence indirecte

Méthode plus spécifique car le 1^e Ac donne la spécificité du virus et le 2^e Ac est le même quelque soit le virus .

• par ELISA

avec capture d’Ag

=> Il y a coloration .

• par hybridation directe : dot blot et in situ

• par Southern blot

on extrait l’ADN du prélèvement
un enz le coupe en morceaux
migration selon le poids moléculaire
transfert par capillarité sur le gel de nitrocellulose
ADN se retrouve dans le filtre
Hybridation par sonde marquée
Un code barre identifie les souches

• par capture d’hybrides

lyse et extraction de l’acide nucléique (ADN) … hybridation avec sonde ARN et on obtient un hybride ARN-ADN … capture par Ac hybrides ARN-ADN … révélation par Ac marqués hybrides ARN-ADN

• par ADN branché

• par amplification par PCR

dénaturation 94° … hybridation amorces 60° … synthèse par la Taq polymérase 72° … 2^e cycle … 3^e cycle….

• transfert de l’énergie par résonance de la fluorescence

Quand les 2 sondes sont collées : transfert d’énergie avec une longueur d’onde analysable et on capte le signal. Au fur et à mesure que les fragments sont synthétisés, le signal augmente et on obtient une coutbe de réémission que l’on suit en temps réel .

• techniques TAQMAN

on met une sonde à activité nucléasique
R : reporter
Q : quencher ( qui éteint le rayonnement ) cad absorbe et va réémettre

Polymérisation

• par amplification génique

TMA : Nasba

Seules les trois premières méthodes sont détaillées ci-dessous car ce sont des techniques générales, utilisées pour tous les virus. Les trois dernières sont vues au fur et à mesure avec les différents virus car elles s’appliquent à des virus particuliers.

NB : il n’y a pas d’échelle de temps car elle est différente selon les virus.
Le losange représente les symptômes de la maladie

Lors d’une infection virale, il y a apparition d’Ig M et d’Ig G contre l’Ag du virus. Les Ig M et G apparaissent à peu près en même temps cliniquement, la différence sur le graphique est due à une sensibilité variable des techniques. Les Ig M peuvent être présents quand le malade est symptomatique alors que les Ig G apparaissent tardivement par rapport au début de la maladie.

Un Ag viral connu est fixé sur une particule de latex. On met en présence les antigènes fixés sur du latex et le sérum du malade. S’il y a présence d’Ac dans le sérum, l’agglutination est visible à l’œil nu. C’est une technique très rapide mais pas toujours très sensible.

Un antigène viral est fixé sur une lame puis mis en contact avec le sérum du malade. Si le sérum contient l’Ac spécifique recherché, celui-ci se fixe sur l’Ag. Les Ac non spécifiques ne se fixent pas. On ajoute ensuite un antisérum marqué à la fluorescéine, dirigé contre la fraction Fc des Ig humaines. Cette technique permet de rechercher les Ig A, M et G.

Cette technique, très utilisée, allie une grande sensibilité et une grande spécificité. On place un Ag viral connu sur un support plastique et on le met en contact avec le sérum du malade contenant l’Ac spécifique de l’Ag viral. On ajoute ensuite des Ac anti Ig humaines marqués par une enzyme. En présence du substrat, et s’il y a présence d’Ac, une coloration apparaît.

En pratique, les réactions Ag-Ac se font dans des puits posés sur une plaque. On mesure la densité optique. Un sérum négatif apparaît incolore. Les sérums positifs peuvent être fortement ou faiblement colorés. Certains sont à la limite du seuil et nécessitent donc un recontrôle.

Cette technique permet la recherche des Ig M et G.

Cette technique confirme une technique Elisa et est utilisée pour la recherche d’Ac contre une protéine spécifique du virus.

Après préparation des filtres, on fait migrer le lysat du virus dans le filtre. Puis, on transfère les protéines filtrées, par capillarité, sur le buvard. Le filtre est découpé en bandelettes afin d’obtenir une bandelette unitaire pour chaque protéine virale.

On recherche ensuite si le sérum du malade contient les Ac dirigés contre les protéines virales.

Ces 3 derniers points étant réservés à des virus particuliers, ils sont détaillés dans les cours sur les virus correspondants

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